Пятов Евгений Александрович, Амантаева Аида Ажибековна Кокшетауский государственный университет им. Ш. Уалиханова, Камзе Анар Рашидовна АО «Кокшетауские минеральные воды» (Кокшетау, Казахстан)
Актуальность. Исследованиями установлено, что в подземных водах присутствует аутохтонная микрофлора различных эколого-трофических групп, которая способна влиять на бальнеологические и физиологические свойства воды [1]. Физиологические группы аутохтонной микрофлоры в процессе своей жизнедеятельности продуцируют сахара, аминосахара, аминокислоты, белки, углеводы., витамины. Аутохтонная микрофлора определяет бактерицидное действие воды, установлена способность природной воды вызывать гибель кишечной палочки. Заслуживают внимания сведения о том, что природные бактерии, присутствующие в разлитой и не разлитой в тару воде, лишены патогенных свойств, так как не вырабатывают токсичных метаболитов, и не способны ухудшать органолептические показатели воды.
Отсюда следует, что важно сохранять в бутилированных природных питьевых водах аутохтонную микрофлору для улучшения физиологических свойств воды. Директива 2009/54/ЕС запрещает проводить обработку подземной воды способами, ведущими к гибели аутохтонной микрофлоры в бутилированной природной минеральной воде [2].
В источниках подземных вод Северного Казахстана, используемых для производства бутилированных питьевых вод, обнаружены физиологические группы аутохтонной микрофлоры [3]. Доказано, что озонирование воды или насыщение ее диоксидом углерода не приводит к гибели аутохтонной микрофлоры [4]. Сохранившаяся в бутилированной воде микрофлора способна обогащать воду органическими веществами, в том числе аминокислотами, участвующими в синтезе белков.
Методики микробиологических исследований, разработанные Украинским НИИ медицинской реабилитации и курортологии (г. Одесса) [5], позволяют изучать наличие аминокислот в подземных и в бутилированных водах. Внедрение методик в производство бутилированных вод является актуальным на данный момент времени. Это расширяет спектр показателей физиологической полноценности питьевых вод наряду с показателями по макро- и микроэлементному составу.
Цель исследования: внедрить в производство бутилированных природных питьевых вод методы оценки способности аутохтонной микрофлоры продуцировать аминокислоты в бутилированных водах.
Задачи исследования: провести микробиологические анализы подземных вод и бутилированных вод из различных источников.
Практическая значимость: применение методик оценки способности аутохтонной микрофлоры продуцировать аминокислоты дает возможность подтверждать природное происхождение бутилированных вод.
Объектом исследования являются образцы воды из различных источников подземных вод и бутилированных вод различных торговых марок. Перечень образцов воды приведен в таблице 1.
Предметом исследования являлись аминокислоты, содержащиеся в образцах воды.
Методика исследований заключается в проведении глубинного бактериального посева проб воды в чашке Петри с последующим культивированием на агаризированной питательной среде Вербиной. Способность выращенных колоний бактерий продуцировать аминокислоты регистрируется при помощи диска хроматографической бумаги, обработанной 0,5%-ым раствором нингидрина в ацетоне [5]. Реакция с нингидрином является универсальной химической реакцией на аминокислоты – конечным продуктом реакции аминокислот с нингидрином является образование аммонийной соли, окрашенной в сине-фиолетовый цвет.
Питательная среда Вербиной готовилась в день проведения исследований. Для приготовления питательной среды использовались калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75, магний сернокислый по ГОСТ 4523-77, натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, кальций хлористый по ГОСТ 4161-77, мочевина по ГОСТ 6691-77, глюкоза по ГОСТ 6038-79, ГРМ- агар по ТУ 9398-020-78095326-2006 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой», вода по ГОСТ 2874-82. Вода с растворенными в ней реактивами в определенных пропорциях кипятилась 2-3 минуты, разливалась во флаконы и автоклавировалась при температуре +112 °С и давлении пара 0,5 атм. в течение 30 минут. Полученная питательная среда охлаждалась до +45 °С.
Таблица 1 – Образцы воды на определение аминокислот (дата проведения анализа: 11.03.2020 г.).
Номер образца |
Наименование образца, место отбора |
Дата отбора образца, производства воды |
Срок хранения образца воды, сут. |
1 |
Кенетколь, скважина 1943, |
5.02.2020 г. |
35 |
2 |
Продукция «TURAN», 5 л. |
5.02.2020 г. |
35 |
3 |
Букпа, скважина No2-Б |
5.02.2020 г. |
35 |
4 |
Букпа, скважина No5-Б |
5.02.2020 г. |
35 |
5 |
Букпа, продукция, газиров., 0,5 л. |
28.01.2020 г. |
43 |
6 |
Букпа, продукция, негазир., 0,5 л. |
28.01.2020 г. |
43 |
7 |
Букпа, продукция, негазир., 0,5 л. |
30.07.2019 г. |
225 |
8 |
Букпа, продукция, негазир., 0,5 л. |
12.11.2019 г. |
120 |
9 |
Кулагер, скважина 5492-Э |
5.02.2020 г. |
35 |
10 |
Кулагер, продукция, газир., 0,5 л. |
27.09.2019 г. |
166 |
11 |
Тассай, продукция, газир., 0,5 л. |
16.10.2019 г. |
147 |
12 |
Тассай, продукция, негазир., 0,5 л. |
04.12.2019 г. |
88 |
13 |
Сарыагаш, продукция, газир., 0,5 л. |
19.12.2019 г. |
83 |
14 |
Боржоми, продукция, газир., 0,5 л. |
5.07.2019 г. |
250
|
15 |
Ессентуки, продукция, газир., 0,5 л. |
14.07.2019 г. |
241 |
16 |
Дистиллированная вода, нестерилизованная |
25.02.2020 г. |
15 |
17 |
Вода из водопровода г. Кокшетау |
11.03.2020 г. |
0
|
Воду из образца в количестве 1 мл вносили в слегка открытую стерильную чашку Петри, равномерно распределяя каплями по внутренней поверхности дна. Затем посевной материал заливали 15 мл агаризированной питательной среды Вербиной, охлажденной до +45 °С. Содержимое чашки перемешивали путем 5-6 оборотов ее на горизонтальной поверхности.
Культивирование посевов проводили при комнатной температуре в течение 5 суток для получения максимального образования аминокислот. На шестой день на поверхность питательной среды с выращенными колониями стерильным пинцетом накладывали диски хроматографической бумаги размером с чашку и прижимали шпателем. Через 2 часа диски снимали пинцетом и сушили в сушильном шкафу ТС-80М-2 при температуре +3010 °С до момента высыхания хроматографической бумаги.
Высохшие диски обрабатывали 0,5%-ым раствором нингидрина в ацетоне и оставляли на одни сутки в темноте. По окончании суток на хроматографической бумаге проявлялись нингидринположительные сине- фиолетовые пятна, свидетельствующие о способности аутохтонной микрофлоры продуцировать аминокислоты и наличии в образцах воды аминокислот.
Микробиологические исследования проводились в аккредитованной бактериологической лаборатории РГУ «Департамент контроля качества и безопасности товаров и услуг Акмолинской области» Комитета контроля качества и безопасности товаров и услуг Министерства здравоохранения Республики Казахстан.
Результаты. Анализируя интенсивность и площадь окрашивания сине- фиолетовым цветом хроматографической бумаги можно сделать вывод, что исходная пресная вода из месторождения «Букпа» дает более яркое и контрастное окрашивание, чем пресная вода месторождения «Кенетколь», и более слабое окрашивание проявилось у образца солоноватой воды из месторождения «Кулагер».
В готовой продукции негазированная вода с месторождения «Кенетколь», прошедшая озонирование, дает интенсивность и площадь окраски на 50 % меньше, чем в исходной воде.
В готовой продукции из воды с месторождения «Букпа» газированная вода характеризуется более ярким, контрастным окрашиванием относительно исходной воды, негазированная вода, но обработанная озоном, с небольшим сроком хранения характеризуется окрашиванием, аналогичным с исходной водой, а негазированная вода со сроком хранения 120 суток характеризуется более слабым на 25 % окрашиванием относительно исходной воды, со сроком хранения 225 суток – более слабым окрашиванием на 50 % относительно исходной воды. Таким образом, сроки хранения влияют на способность макрофлоры продуцировать аминокислоты, тем не менее, выделенные аминокислоты свидетельствуют о наличии микрофлоры в продукции, хранившейся длительный срок.
В готовой продукции из воды с месторождения «Кулагер» газированная вода со сроком хранения 166 суток характеризовалась меньшей на 30 % площадью окрашивания относительно исходной воды.
Газированная вода «Тассай» во всех образцах дала яркое, интенсивное окрашивание, отличное от всех образцов других вод, с одиночными округлыми пятнами от темно-фиолетового до черного цвета.
Лечебно-столовые газированные воды «Сарыагаш», «Ессентуки», «Боржоми» с большими сроками хранения от 83 до 250 суток дали следующую картину. Характер и интенсивность окрашивания хроматографической бумаги в образцах воды «Сарыагаш» и «Ессентуки» близки к образцу газированной воды из месторождения «Букпа». Вода «Боржоми» (250 суток хранения продукции) дала едва заметное окрашивание бумаги.
На хроматографической бумаге с образцом водопроводной воды проявились пятна светло-розового цвета. Нестерилизованная дистиллированная вода дала на бумаге яркую фиолетовую окраску небольшой площади, что свидетельствует о попадании в воду микроорганизмов из окружающей среды.
Заключение. В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
- в подземных водах испытанных образцов присутствует аутохтонная микрофлора, способная продуцировать аминокислоты;
- в озонированной и газированной бутилированной воде сохраняется способность микрофлоры продуцировать аминокислоты;
- способность природной микрофлоры, содержащейся в бутилированной воде, продуцировать аминокислоты сохраняется длительный срок, но со временем снижается;
- данный эксперимент показывает, что в газированной воде процесс продуцирования аминокислот проявляется более интенсивно, чем в исходной негазированной воде или в воде после озонирования; данное явление требует проверки, так как оно может являться одним из факторов по отнесению углекислых газированных вод к лечебным;
- в озонированной воде способность аутохтонной микрофлоры продуцировать аминокислоты снижается относительно исходной воды из подземного источника;
- рекомендуется производителям бутилированных вод использовать данную методику для подтверждения сохранности природных свойств воды в готовой продукции.
Исследования выполнены в рамках дипломной работы в АО «Кокшетауские минеральные воды» на базе филиала кафедры химия и биотехнология КГУ им. Ш. Уалиханова.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
- Минеральные лечебные воды курортов Крыма /Второе издание/ под ред. К.Д. Бабова, Е.М. Никипеловой. – Одесса; 2012. – 220 с.
- Directive 2009/54/EC of the European parliament and of the council of 18 June 2009 on the exploitation and marketing of natural mineral waters.
- Пятов Е.А., Бабов К.Д., Никипелова Е.М., Николенко С.И. Автохтонная микрофлора в подземных водах Северного Казахстана и ее значение для здоровья человека // Научно-практический журнал «Валеология». - Медицинский университет Астана. – Астана. - 2010. - No.1 – С. 39-43.
- Пятов Е.А., Алпысова А.Р., Сергазина С.М., Калипенова М.Е. Водоподготовка и сохранение природной микрофлоры в производстве бутилированных питьевых вод на примере маслянокислых бактерий // Водные ресурсы и водопользование. – Астана. – 9 (164) 2017. – С. 24-27.
- Нiколенко С.I., Глуховська С.М., Хмєлєвска О.М., Петровська В.Б. Посiбник з методiв контролю природних мiнеральных вод, штучно-мiнералiзованих вод, напоїв на їх основi та преформированих засобiв. – Ч.2. Мiкробiологiчнi дослiдження. – Київ. – Видавництво «КIМ» - 2011. – 52 с.